柯薩奇病毒(CV)熒光探針法PCR檢測試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：柯薩奇病毒 A6 型（CAV-6）核酸檢測試劑盒(RT-PCR 熒光探針法)

Name ：Diagnostic Kit for Coxsackievirus type A6 RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)

【包裝規(guī)格】48 份/盒

【預期用途】

本試劑盒適用于檢測的糞便或腹瀉物等標本中柯薩奇病毒 A6 型 RNA，適用于柯薩奇病毒 A6 型感染的輔助診斷。其檢測結(jié)果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對柯薩奇病毒 A6 型特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對柯薩奇病毒 A6 型 RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

酶液 50μl×1 管

CAV-6 反應(yīng)液 1.0ml×1 管

CAV-6 陽性質(zhì)控品 50μl ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μl ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融少于 5 次，

有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ

Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

取糞便或腹瀉物置入無菌玻璃管中，用無菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標

本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

取黃豆顆粒大小糞便或 100uL 水樣腹物置于 1.5mL 離心管中，按 RNA 提取試劑

盒說明書進行提取。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取

法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性

對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 CAV-6 反應(yīng)液 酶液

用量 20μl 1μl

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μl，分別加入相應(yīng)的反

應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul；熒光通道選擇：

檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿

選擇 ROX 參比熒光。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle

94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲

線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15

范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value

值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

6. 檢測方法的局限性

樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或

定量檢測不準確的結(jié)果；

本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

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