甲型流感H1N1亞型IAV-H1N1熒光PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

商品名稱(chēng)：甲型流感病毒 H1N1 (IAV-H1N1) 核酸檢測(cè)試劑盒 (熒光-PCR 法)

Name ：Influenza A virus subtype H1N1 Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

甲型流感H1N1是一種RNA病毒，屬于正黏液病毒科。它的宿主是犬科動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和一些哺乳動(dòng)物。幾乎所有甲型的 H1N1 病毒已被隔離，野生鳥(niǎo)類(lèi)出現(xiàn)疾病屬罕見(jiàn)。有些 H1N1 病毒引起嚴(yán)重的疾病大多發(fā)生于家禽和寵物方面，而人類(lèi)卻很少出現(xiàn)。但經(jīng)過(guò)鳥(niǎo)類(lèi)和犬科動(dòng)物為主的哺乳動(dòng)物的傳播和變異，這可能導(dǎo)致疫情或人類(lèi)流感大面積傳播。

本試劑盒適用于檢測(cè)鼻咽拭子、氣管分泌物等標(biāo)本中的甲型流感病毒 H1N1RNA，適用于甲型流感病毒 H1N1 型感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒根據(jù)甲型流感病毒 H1 型 HA 基因、N1 型的 NA 基因分別設(shè)計(jì)的特異性引物和熒光探針[1-3]，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對(duì)甲型流感病毒 H1N1 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

注：

1）不同批號(hào)試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò)5次，有效期9個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量PCR檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

患病動(dòng)物：鼻咽咽拭子、氣管分泌物；血液：用一次性無(wú)菌注射器抽取靜脈血

2mL。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)

本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

鼻咽棉拭、氣管分泌物取 100μl。血液樣品，3000rpm 離心 5min，吸取 100μL 上層血清，轉(zhuǎn)移至 1.5mL 滅菌離心管

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；樣品每滿(mǎn) 7 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM、ROX， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，

請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5. 結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線(xiàn)出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線(xiàn)至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

FAM 通道為甲型流感病毒 H1N1 中 H1 基因檢測(cè)結(jié)果，ROX 通道為甲型流感病毒 H1N1 中 N1 基因檢測(cè)結(jié)果

陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35.0，且曲線(xiàn)有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線(xiàn)。

可疑：檢測(cè)通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線(xiàn)的樣本建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)

試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴(kuò)增曲線(xiàn)者為陽(yáng)性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果無(wú) Ct 值且無(wú)明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)。

6. 檢測(cè)方法的局限性

Ø 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

Ø 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；

Ø 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

Ø 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

Ø 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或

定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；

Ø 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無(wú)明顯擴(kuò)增曲線(xiàn)且無(wú) Ct 值顯示；

陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線(xiàn)有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32；

以上條件應(yīng)同時(shí)滿(mǎn)足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

【注意事項(xiàng)】

Ø 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；

Ø 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；

Ø 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

Ø 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；

Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

Ø 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

Ø 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全

通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

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H1N1 流感病毒[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2010.

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[3] 侯義宏, 王慧煜, 梅琳. 甲型 H1N1 流感病毒一步法多重 RT-PCR 檢測(cè)方法的

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