黃曲霉總量快速檢測試劑盒（ELISA法）

使用說明書

（酶聯免疫法）

 1 原理及用途

黃曲霉是由黃曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產生的次級代謝產物，主要污染玉米、花生、堅果等。黃曲霉以 AFB1、AFB2、AFG1 和 AFG2 這四種毒素為主，黃曲霉總量一般是指這四種毒素的總量。它們是 I 類致癌物，被證明對人和動物的肝臟、腎臟等組織和器官具有很大的危害，是一類毒性很強的致癌物質。

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測谷物、花生、飼料等樣品中的黃曲霉，試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的黃曲霉和酶標板上預包被偶聯抗原競爭抗黃曲霉抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含黃曲霉含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中黃曲霉的殘留量。

2 技術指標

2.1 試劑盒靈敏度：0.02ppb(ng/ml)

2.2 反應模式：25℃，30min～15min

2.3 檢測下限：

谷物……………………………………0.1ppb

飼料……………………………………0.2ppb

2.4 交叉反應率：

黃曲霉B1…………………………100%

黃曲霉B2…………………………80%

黃曲霉G1…………………………75%

黃曲霉G2…………………………45%

黃曲霉M1…………………………8%

 2.5 樣本回收率：

谷物及配合飼料……………………85%±15%

3 試劑盒組成

酶標板……………………………96孔

標準液（黑蓋）：各1ml

0ppb、0.02ppb、0.04ppb、0.08ppb、0.16ppb、0.32ppb

高標準液：100ppb …………………1ml

酶標記物（紅蓋） …………………5.5ml

抗體工作液（藍蓋） ………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：甲醇

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結果。

5.2 配液：

配液1：樣本提取液

70%甲醇，即V甲醇:V去離子水=7：3。

配液2：工作洗滌液

將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 谷物處理方法

1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加5ml樣品提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

2）取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水，混勻；

3）取50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數：5    檢測下限：0.1ppb

5.3.2 配合飼料處理方法

1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加10ml樣品提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；

2）取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水，混勻；

3）取50μl進行分析。

樣本稀釋倍數：10    檢測下限：0.2ppb

（若樣本中黃曲霉含量較高，可取2）步驟中已混勻的液體，以35%甲醇進行稀釋，此時樣本稀釋倍數則為實際稀釋倍數。例如：取2）步驟中液體以35%甲醇10倍稀釋，實際稀釋倍數為10×10=100，檢測下限：2ppb）

6 酶聯免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復洗滌5次，后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍色過淺，可適當延長反應時間）。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應。

6.6 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內完成。

7 結果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算

    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 黃曲霉總量快速檢測試劑盒（ELISA法）貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。